Aprendamos un poco sobre la microscopia electrónica de Transmisión (TEM) (Preparación de espécimen/muestras)
Hace algunos días atrás escribí mi ultimo post sobre el microscopio electrónico de transmisión explicando como esta conformado y que función tiene que cada parte de este aparato.
Lamentablemente no he tenido la oportunidad de trabajar con este tipo de equipos, pero en mi corta carrera como investigador científico estoy muy seguro que en un futuro cercano trabajare el día a día con los microscopios, por que sin duda alguna es un mundo fascinante y en lo particular me apasiona.
Continuando este tipo de temas explicare algunas de los métodos más usados para la preparación de especímenes que luego deben ser observados mediante el TEM.
Imagen CCO Creative Commons Carlos Gatica
Preparación de espécimen para el microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Para utilizar este equipo es necesario preparar la muestra del material, ya sea semiconductor u otro, en forma de una lámina ultra-delgada o delgada, generalmente se corta en un disco con un diámetro aproximado de 3 a 4 mm, el la muestra debe ser lo suficientemente fina para que los electrones penetren a través de la muestra y la imagen se pueda obtener de la manera que deseamos.
El grosor de la muestra varía según el material que vamos a caracterizar, un grosor de aproximadamente 100 micras se usa comúnmente para elementos con un alto número atómico, que ofrecen mayor resistencia que aquellos con un número atómico menor, por lo general, varía entre 100 y 200 micras.
A veces el procedimiento de preparación puede tornarse algo complejo, dependiendo del material que vamos a usar, por ejemplo: aquellos materiales que tienen un grosor muy pequeño como organismos, bacterias, sustancias en polvos e inclusos nanotubos son difíciles de preparar, pero se pueden realizar de una forma en la que el espécimen pueden diluirse con algún químico en especifico que contendrá la muestra del material en películas muy delgadas sobre las rejillas del soporte del TEM.
En cambio los especímenes biológicos pueden incrustarse en una sustancia orgánica, pegajosa y muy transparente llamada resina, que esta puede resistir un alto vació en la cámara del microscopio que a su vez permita cortar los tejidos de las muestras en varias partes muy delgadas para que los electrones puedan penetrar la muestra.
Otro punto a destacar es que estos especímenes biológicos pueden tener un color diferente usando un material como acetato de uranio, esto se hace con las bacterias y virus, o en dado caso la muestra pueden teñirse con metales muy pesados como el peróxido de uranio.
Y en mi área la preparación de las muestras también pueden realizarse de forma distinta a las demás áreas, por lo general pueden soportar un alto vació en la cámara del TEM, ya que son materiales metálicos (semiconductores), pero no se puede cambiar la forma, se deben preparar en laminas delgadas para que los electrones también puedan penetrar la muestra, a su vez pueden tener ciertas limitaciones con respecto al espesor y están vienen limitadas de acuerdo a la sección transversal por la dispersión de átomos con la cual debe estar conformado el material.
A continuación les mostrare algunos métodos que se utilizan para preparar especímenes que luego serán caracterizados por el microscopio electrónico de transmisión.
Métodos para preparar especímenes (TEM)
- Una de las principales técnicas de preparación de muestras que se utilizan para la caracterización mediante el microscopio electrónico de transmisión es el corte mecánico y esmerilado que consiste básicamente en la eliminación de material utilizando partículas abrasivas en los sucesivos pasos de refinamiento, para eliminar el material de la superficie hasta lograr el resultado requerido.
La molienda consiste en la eliminación de todos los defectos del material, la corrosión, el óxido y las deformaciones, de modo que es completamente plano para un mejor análisis y obtener resultados.
Ultramicrotomo Imagen bajo licencia Creative Commons MST
- Los especímenes que cuentan con tejido biológico se pueden preparar incrustando una porción de resina, como mencione en el párrafo anterior es una sustancia orgánica pegajosa y transparente, su principal función es adherir la muestra al micrótromo para luego ser cortada, esta se debe diluir a un diámetro de 100 micras aproximadamente en dicho aparato, luego la resina de rompe al pasar el borde del cuchillo del micrótomo, este puede ser del cristal o diamante. Este método se usa mucho para poder cortar laminas muy delgadas y es sumamente efectivo, ya que al obtener las muestras estas presentan una mínima deformación son casi perfectas por decirlo así y pueden permitir una fácil observación mediante el microscopio.
Sección ultrafina de una megaspora de Salvinia cucullata Imagen bajo licencia Creative Commons Kempf EK
Muy importante tener en cuenta es que para evitar la acumulación de carga en la superficie de la muestra, estos se deben cubrir con una mínima capa de material conductor, como el cobre o carbono.
Estos especímenes necesitan tener una gran cantidad decoloración en su superficie que corresponde a un gran numero atómico para generar una diferencia notable. Esta decoloración en la muestra debe absorber parte del haz de electrones que sera proyectado en la pantalla y visualizar las imágenes.
Aquellos materiales que están compuestos por metales bastante pesados es preferible usarse antes de la observación de microscopio con la finalidad de dejar en un lugar determinado átomos con una alta densidad del electrones. Todo este proceso requiere un estudio bastante profundo sobre como los metales deben unirse a los tejidos biológicos y estructuras celulares, de lo contrario podrías tener problemas a la hora de preparar cierta cantidad de tejidos con incrustación de metales y por ende malos resultados en la observación.
- Otro metodo es el pulido electrolítico que se utiliza para diluir el material correctamente sin errores o imperfecciones en su superficie, en este proceso se elimina toda la rugosidad del material, dejándolo libre de suciedad.
El electropulido es un tratamiento superficial mediante el cual el metal a pulir actúa como un ánodo en una celda electrolítica, disolviéndose. Con la aplicación de corriente, se forma una película polarizada sobre la superficie metálica en tratamiento, permitiendo que los iones metálicos se difundan a través de dicha película.
- Por otro lado el fresado o pulido mecánico es un método bastante usado y muy eficaz para obtener imágenes de alta resolución en el TEM. Se debe tener en cuenta ciertos detalles para realizar un perfecto pulido de alta calidad y así nos pueda garantizar que la muestra mantenga un espesor ideal y constante en toda su superficie, para este procedimiento se usan ciertos compuestos químicos como el nitruro de boro que permite que la muestra se vea muy brillante en toda su superficie, a su vez esto compuesto ayuda a eliminar cualquier ralladura, sucio y deformación en toda la superficie del espécimen. Se debe hacer con mucha delicadeza ya que algunos materiales son muy fácil que se puedan fracturar durante la preparación, con esto me refiero a que no se debe presionar muy fuerte durante el pulido.
Para finalizar en la etapa final luego de haber realizado todo el fresado mecánico es recomendable realizar otros método adicionales como el grabado iónico para así obtener una perfección total en la muestra y que permite una alta resolución en las imágenes del TEM.
- El grabado iónico es un proceso de pulverización que permite eliminar cualquier cantidad de sucio, corrosión o alguna sustancia no deseada en el material, este método se realiza luego del pulido mecánico, que tiene como finalidad eliminar esas pequeñas manchas que no podemos observar a simple vista.
Sistema de pulverizacion de la Universidad de Alabama Imagen bajo licencia Creative Commons AlabamaUSA
Es crucial que a cualquier daño a las capas producidas en la preparación mecánica preliminar se elimine por completo en los pasos sucesivos de electropulido o grabado iónico. El adelgazamiento final continúa hasta que el primer orificio aparece al lado del centro del disco; Luego, los procesos de pulido electrolítico o iónico se detienen inmediatamente. Las partes más delgadas adyacentes al orificio suelen ser delgadas y transparentes para los electrones. Si continúa el electropulido o el grabado con iones, las secciones delgadas y transparentes a los electrones adyacentes al orificio se eliminarán y el material restante puede no ser lo suficientemente delgado como para permitir que entre el haz de electrones.
- Algunos especímenes se pueden acondicionar a través de una técnica muy parecida a la anterior, consiste en el fresado químico, por lo general se preparar materiales metálicos, en mi caso los semiconductores. Comenzando deben tomarse las muestras y colocarla en un envase que contenga sustancias químicas como ácidos. Y luego se procesa a fresar la muestra. Esta técnica tiene la particularidad de que los aparatos especializados para esta preparación se pueden controlar cuando se esta realizando el proceso de reducción de la muestra y a su vez podemos controlar el voltaje y corriente en el dispositivo que pasa a través del metal. También cuentan con algunos sistemas que pueden detectar si el espécimen se ha diluido lo suficiente para que se muestre una transparencia óptica
Principio del FIB Imagen bajo licencia Creative Commons Kriegor27
- Y el ultimo método que voy a mostrar en este post es el haz de iones enfocados (FIB). Es una de las técnicas más novedosas para preparar muestras finas que posteriormente serán analizadas en el TEM, a través de este método es posible fresar membranas muy delgadas en un área en especifico del espécimen, es una técnica muy precisa para preparar muestras semicondcutoras a diferencia de la pulverización que usa un gas inerte, en este proceso se usa iones de GA.
Conclusiones
El microscopia electrónico de transmisión es y ha sido parte fundamental de los descubrimientos a lo largo de la historia científica, es una herramienta que ha facilitado el trabajo de los científicos en diferentes áreas.
Este microscopio es encarga de emitir un haz de electrones, posteriormente es direccionado hacia el espécimen que desea observar. Una parte de los electrones debe rebotar en la muestra y la otra parte es absorbida por el material y de esta forma se forma la imagen que aumenta el microscopio. Los electrones tienen una longitud de onda mucho más corta que la luz visible y el SEM, por lo que muestran estructuras más pequeñas.
Las imágenes que se incrementan en el TEM ofrecen información importante sobre la estructura del material y cómo el TEM también se puede ver en su superficie, en este caso podemos corroborar si el material es amorfo o cristalino.
La preparación de los especímenes que se desean observar en este microscopio es esencial para el estudio del mismo, a parte de recorrer toda los fundamentos teóricos para el manejo de este equipo que resultan bastante complejo y lleva tiempo de estudio, es importante realizar un buen proceso de acondicionamiento instrumental, preparación y montaje de la muestra. Y la pregunta es ¿porqué?.
De manera muy sencilla de explicar, podría decir que un mal manejo instrumental y una mala preparación del espécimen, traería como resultados una mala experiencia, es decir, al momento de analizar a través del TEM podríamos obtener fallas en dicha observación, perdida de tiempo, molestia y frustación, es por ello que los científicos tratan de desarrollar nuevas técnicas que resulten menos complejas, las ya mencionadas resultan serlo pero con un buen estudio y practica se lograría estar cercano a la perfección.
Este tipo de equipos son muy delicados, en mi caso si deseo analizar algún espécimen es bueno tener a disposición a personas experimentas que te ayuden orientándote el paso a paso del funcionamiento de este equipo.
Muchas gracias por tomarte el tiempo de leer este escrito, espero seguir aportando artículos que ayuden a crecer la comunidad.
Para más información
Techniques in Electron Microscopy of Animal Tissue
N. F. Cheville, J. Stasko
ACERCA DE LA PREPARACIÓN PARA MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN
Metodología de la microcopia electrónica
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Saludos Carlos
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Very good posts, hopefully you can always be successful in the esteem business
Muy buena información, como el post anterior. La ayuda de esta tecnología con respecto a la parte de salud es fenomenal. Lo que me gusto también es que ya existen varias y nuevas técnicas para los cortes de las muestras , de las que no había leído y son tan impresionantes. Cuando comenzamos en esta andanza con la ciencia no nos imaginamos todo lo que nos espera y lo que hay detrás. Saludos.
Definitivamente se trata de una herramienta que ha marcado desde su invención, un antes y un después. Se agradece que muestres en tu publicación este enfoque fabuloso de la ciencia y la tecnología al servicio de la comunidad científica. Felicitaciones estimado @carloserp-2000
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Se despide el equipo de Capybara Exchange.
Saludos @carloserp-2000. Excelente trabajo como siempre. Los alcances de la microscopia electrónica son fascinantes. Gracias por cultivarnos.